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原创以腐生或寄生方式生存
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标准物质网-真菌毒素的原创课程讲师图" src="https://shijiaoke.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/News/zhaoxiaocaokechnegjieshaotu20200429.png" style="width: 800px; height: 447px;" />
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真菌毒素是真菌生长过程中产生的代谢物,污染食品与农作物,食品素给人的菌毒检测身体健康带来一定的危害,对农业生产具有巨大的原创危害性。了解常见的食品素真菌毒素的危害及其检测方法,可以为进一步控制真菌毒素污染提供参考价值。菌毒检测
一、原创真菌毒素的食品素概念
真菌:是一类有细胞壁,不含叶绿素,菌毒检测无根茎叶,原创以腐生或寄生方式生存,食品素能够及进行有性或无性繁殖的菌毒检测微生物;
霉菌:是丝状比较发达的小型真菌的俗称;
真菌毒素:是由真菌产生的次级代谢产物。即由细胞增殖过程中形成的原创丙酮酸、酯酸、食品素氨基酸等初级代谢产物作为前提物质,菌毒检测进行生物合成的物质。一般分为霉菌毒素和蘑菇毒素。
二、真菌毒素的种类
已知有200多种不同的真菌毒素,一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中包括:黄曲霉毒素B1和M1 (Aflatoxins, FB1、FM1);赭(棕)曲霉毒素A (Ochratoxin A, 0A) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素) (Deoxynivalenol, DON); 玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN(F-2)) ; T-2毒素(T -2 toxin,T-2); 伏马霉素; 展青霉素(棒曲霉毒素) (Patulin, PTL);杂色(柄)曲霉毒素(terigmatocystin); 串珠镰刀菌素(Moniliformin, MF)三硝基丙酸; 二乙酰镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol DAS)、麦角碱、黄米毒素、岛青霉毒素、橘青霉素、皱褶青霉素、黄绿青霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和F- 2毒素等。
(1)真菌毒素之黄曲霉毒素
黄曲霉毒素(Aflatoxins。简写AFT)是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒菌株的代谢产物,是群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素。根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类:
B大类在氧化铝薄层板上于紫外光照射下呈现蓝色荧光;
G大类则呈绿色荧光。
(2)真菌毒素之赭曲霉素
毒性:主要对肾产生危害,造成肾肿大,当浓度超过5mg/Kg时,对肝脏组织和肠道产生破坏,引起肠炎等。无色结晶化合物,易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液中,微溶于水,在紫外光照射下,呈绿色荧光,该化合物稳定,在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不被破坏,但在谷物中随时间延长而降解。
存在于:粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料、啤酒等。
检测方法:薄层层析法、液相色谱法。
(3)真菌毒素之玉米赤霉烯酮
玉米赤霉烯酮也称F-2毒素。镰刀菌属的多个菌种如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、粉红镰刀菌、半裸镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀茵、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌等都可以产生该毒素。这些菌广泛存在于土壤、空气及污染的谷物中,主要污染玉米,也污染大麦、小麦、燕麦等。玉米的阳性检出率可达45%,最高含毒量可达2909 mg/蝇,小麦的阳性检出率可达20%,含毒量为0.36~11.05 mg/k。
检测方法:高效液相色谱法。
(4)真菌毒素之伏马菌素
自然界中最为普遍,毒性强,损伤肝肾功能白色粉末,易溶于水、甲醇、乙腈等溶剂,在甲醇溶液中不稳定,在乙腈水溶液中非常稳定。
检测方法:高效液相色谱法。
(5)真菌毒素之展青霉素
展青霉毒素是多种真菌的有毒代谢产物,该物质方面是一种广谱的抗生素,另一方面对小鼠、兔子等试验动物具有较强的毒性。其污染食品和饲料后产生的毒性远大于其抗菌作用。
(6)真菌毒素之杂色曲霉毒素
毒性:引起肿瘤
污染:小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等。易溶于氯仿、苯、吡啶、乙腈,微溶于甲醇、乙醇,不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下,呈砖红色荧光。
检测方法:薄层法,紫外分光光度计测定。
三、真菌毒素的检测
(一)前处理
1. 采样和样品的准备
(1)根据分析目的的不同确定采样地点,如:农田、仓库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。
(2)采样方法:
静态样品:麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均属静态样品。
采样工具:顶端尖锐的长柄采样钎子。
采样数量:小批量时采1/4;大批量时为整批麻袋数。
动态样品:用商品化的十字交叉切分自动采样器。
(3)采样量采大样,按四分法对角连续多次分样缩减至1 - 2kg,最后取代表样全部粉碎。美国农业部USDA的方法:成批样每批取3份大样,每份22kg。实验室分析用的样品为1- 5kg。
2.提取
(1)提取溶剂
溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统。
常用溶剂:甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种不同配比的混合物。
(2)提取温度
温度影响毒素的回收率,适当升高温度可以增加毒素的回收率。
(3)食品基质
固体食品:选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。
液体食品:液-液分配方法
3.纯化
纯化:在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称为纯化。
常用净化方法:液-固萃取、液-液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及SFE法等。使用最广泛的是色谱法。
色谱法:薄层色谱法(柱色谱法最常用)
吸附色谱柱常用的吸附剂:硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土。
分配色谱柱常用的填充剂:硅藻土、纤维素。
固相提取 (广泛采用) ;免疫亲和柱IAC (应用于农产品的新技术)。
(二)真菌毒素的检测方法
1.薄层色谱测定法
实验原理:样品经提取、净化、薄层分离后,某些真菌毒素在紫外光下,产生特定荧光,以标准品做参比,根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来定量。
适用范围:适合于本身能够产生荧光的真菌毒素。如:AFB、OTA
优点:经济、对设备和检验人员要求不高。
2.高效液相色谱法
实验原理:样品中的真菌毒素经柱层析分离后,通过测量色谱峰的面积定量。
优点:特异性强、灵敏度高、定量准确。
分析时应该考虑流动相、色谱柱、柱温和检测器等分析条件,找出最佳配比。
有荧光的用荧光检测器,B类单端孢霉烯族化合物本身不产生荧光,但C6位置上有酮基,可配紫外检测器检测。
应用:选择高效液相-荧光分光光度法是定量测定农产品中玉米赤霉烯酮污染最可靠、亦是最常用的方法。
3.免疫亲和柱-荧光计快速检测法
实验原理:利用抗原一抗体免疫反应的原理,使用大剂量的单克隆抗体,选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附,用水将杂质洗脱除去,再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱,达到分离净化目的。
免疫反应:指抗原和抗体分子的结合。抗原抗体复合物的形成要求二者结构有互补性,抗原与抗体的结合液因此具有高度特异性。
优点:高度特异性、高灵敏度、快速简便等。
4.快速检测卡检测法
检测原理:测定基础是抗原抗体反应,抗体连接在柱体内,样品经过提取、过滤后,缓慢的通过赭曲霉毒素的免疫亲和柱,在免疫亲和柱内毒素与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱,除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱赭曲霉毒素A,然后再注入到分析仪器中用于检测。
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